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                            細胞計數

                            PBMC(外周血單個核細胞)是免疫學功能研究中最常用的細胞模型,如細胞增殖、細胞毒性、細胞因子分泌等。如何精確、快速、簡便計數PBMC以及精確分析PBMC活力,是免疫學研究以及免疫治療領域至關重要的步驟。常規的計數方法有臺盼藍細胞計數、雙熒光法AO/PI細胞活率計數。

                            1.       臺盼藍細胞計數法

                            臺盼藍(Trypan Blue)是組織和細胞培養中最常用的死細胞鑒定染色方法之一?;罴毎粫蝗境伤{色,而死細胞會被染成藍色。細胞計數一般用血細胞計數板,便于確定細胞的生長狀況。

                            機理:正常的活細胞,胞膜結構完整,能夠排斥臺盼藍,使之不能夠進入胞內;而喪失活性或細胞膜不完整的細胞,胞膜的通透性增加,可被臺盼藍染成藍色。通常認為細胞膜完整性喪失,即可認為細胞已經死亡。因此,借助臺盼藍染色可以非常簡便、快速地區分活細胞和死細胞。

                             

                            實驗內容與方法:

                            1. 制備細胞懸液 將細胞用培養基(Thawing Medium)制備成適當濃度的細胞懸液備用,建議使用3ml巴氏吸管混勻細胞。

                            常規的稀釋倍數

                            IMG_256

                            2. 染色 取10ul細胞懸液與10ul臺盼藍染液混合。

                            3細胞計數 

                            1)計數板處理 用無水乙醇或 95% 乙醇溶液擦拭計數板后,用綢布擦凈,另擦凈蓋玻片一張,把蓋片覆在計數板上。

                            2)加樣 從計數板邊緣緩緩滴入染色后的懸液,懸液充滿計數板和蓋片之間的空隙中。注意不要使液體流到旁邊的凹槽中或帶有氣泡,否則要重做。稍候片刻,將計數板放在低倍鏡下(10×10 倍)觀察計數。

                            3)計數方法 按圖計算計數板的四角大方格(每個大方格又分 16 個小方格)內的細胞數。

                             

                            IMG_257

                            Ø 計數時,只計數完整的細胞,若聚成一團的細胞則按一個細胞進行計數。

                            Ø 在一個大方格中,如果有細胞位于線上,一般計下線細胞不計上線細胞,計左線細胞不計右線細胞。二次重復計數誤差不應超過 ±5%。

                            Ø 鏡下觀察,凡折光性強而不著色者為活細胞,染上藍色者為死細胞。

                             

                            細胞計數公式:活細胞數目=大方格細胞數目平均值x稀釋倍數x __ mL =__ x 104

                            細胞活力公式:活細胞數目÷細胞總數= __%

                             

                            2.       雙熒光法AO/PI

                            AO/PI試劑由可以發出綠色熒光的DNA結合染料吖啶橙(AcridineOrange,簡稱AO)和可以發出紅色熒光的DNA結合染料碘化丙啶(Propidiumiodide,簡稱PI)組成。其中AO可以通過完整的細胞膜,嵌入所有細胞(活細胞和死細胞)的細胞核,呈現綠色熒光;PI只能通過不完整的細胞膜,即死細胞的細胞膜,嵌入所有死細胞的細胞核,呈現紅色熒光。

                            由于AO和PI為DNA結合染料,因此可有效排除雜質以及紅細胞的干擾,確保對樣品進行準確計數。

                            目前臺盼藍計數還是市場上主流的細胞計數方法。但在細胞治療行業,需要測量復蘇時的免疫細胞活率和數量,臺盼藍的技術原理已經不能滿足其需求,雙熒光AO/PI計數的方法變得越來越普及。

                             

                            妙順生物 專注于原代細胞

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                            2020-05-13
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